地質と土地利用が太平洋島帯水層の窒素と硫黄循環の地下水微生物群集を形成する

ISME Communications volume 3、記事番号: 58 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

ハワイでは、資源に制約のある島々の住民が1000年以上にわたって繁栄してきましたが、現在、水資源の安全性と持続可能性を含む、基本的な資源に対する新たな挑戦的な課題に直面しています。 地下水生態系の微生物群集を特徴付けることは、水文地質学的複雑な帯水層における土地管理による人間の影響による変化を推測するための強力なアプローチです。 この研究では、地質学と土地管理が地球化学、微生物の多様性、代謝機能にどのような影響を与えるかを調査します。 私たちは、ハワイ州コナのフアラライ流域の合計 19 の井戸を 2 年間にわたってサンプリングし、16S rRNA アンプリコン配列決定によって地球化学と微生物群集を分析しました。 地球化学分析の結果、北西の火山地溝帯に沿って硫酸塩が著しく高く、窒素 (N) が高いことが敷地内下水処理システム (OSDS) の高い密度と相関していることが明らかになりました。 推定上の N および硫黄 (S) サイクラーとして分類された 865 個の ASV を含む、合計 12,973 個のアンプリコン配列バリアント (ASV) が 220 サンプルで同定されました。 N および S サイクラーは、完全な脱窒と結合した推定上の S 酸化剤 (Acinetobacter) によって支配されており、地球化学によってグループ化されたサンプルの中で最大 4 倍まで大幅に濃縮されました。 アシネトバクターの顕著な存在は、地下水帯水層に依存する島の個体群に生態系サービスを提供する、微生物駆動による結合した S 酸化と脱窒に対する火山地下水の生物修復の可能性を推測します。

微生物は、水文学、地質学、土地利用の間の複雑な相互作用において調節的な役割を果たしています [1, 2]。その結果、非常に変動性の高い地下水生物地球化学が生じます。 地下の地下水帯水層の微生物は地球上の微生物のおよそ 40% を占めており [3, 4]、きれいな飲料水の提供などの生態系サービスにとって極めて重要です。 地下微生物群集は、有機物質を分解し、窒素 (N)、硫黄 (S)、鉄 (Fe) を循環させることによって水質を改善します [5]。 堆積系の酸化還元構造とは異なり、固有の微小環境（バイオフィルム、粒子など）では相反する酸化還元反応が同時発生し、その結果、大規模な地下水生生息地に多様な地下水マイクロバイオームが形成されます[6、7]。 その結果、エネルギー源としての無機化合物の使用（化学合成独立栄養）は、地下水生態系における非常に一般的な代謝経路であり、多くの場合、酸素（O）および硝酸塩との炭素（C）、水素（H）、および硫黄（S）サイクルに関連しています。 (NO3-) は最も広く使用されている電子受容体です [1]。 ハワイの深層地下水帯水層で実施された数少ないマイクロバイオーム研究の 1 つでは、分析により、主に化学分解栄養性代謝によって特徴付けられる高度な機能的多様性が明らかになりました [8]。

地下水生態系の微生物群集を特徴付けることは、人間の影響や水文地質学的に複雑な帯水層における土地利用から生じる地球化学的変化を推測するための強力なアプローチです [9、10]。 地下の微生物群集の構造と多様性の変化は、利用者に水質の低下を警告する可能性があります。これは、地下の微生物が土地利用の変化や汚染物質による環境の変化に迅速に反応し、多様性の減少と生物地球化学経路の短縮をもたらすためです [11、 12]。 ハワイではすべての水資源がほぼすべて地下水に依存しているため、これは特に重要です。 ハワイの飲料水供給の約 89% は地下水資源にあり、地表水 (つまり、貯水池、雨水) [13] や小規模の淡水化活動からの寄与は最小限です。 ハワイは米国で人口当たりのセスプールの数が最も多い[14]。 個人の敷地内下水処理システム (OSDS、セスプール) と農業からの非点源汚染は、沿岸生態系に影響を与える人間由来の栄養素の 2 つの主要な発生源であり、ハワイでは主要な環境問題として認識されています [15,16] 、17、18]。

窒素は、地下水における最も一般的な非点源汚染物質の 1 つです [12、19、20]。 N の投入量は主要なイオン地下水地球化学の重要な決定要因であり [21]、地下微生物群集は人為起源の N の影響と地表水または沿岸生態系への移行を制御する役割を担っている [22、23、24]。 独立栄養性脱窒は、貧栄養地下水における主要な窒素除去プロセスであり、亜硝酸塩 (NO2-) または硝酸塩 (NO3-) をガス状窒素 (N2) に還元することによって無機化合物 (Fe、S、マンガン、Mn、水素ガス、H2) が酸化されます。 [25]。 [23、26]。 さらに、微生物による脱窒は、1980 年代までは唯一のプロセスであると考えられていた嫌気性と、硫化物酸化廃水処理プラントで最初に報告された好気性の両方で発生する可能性があります [27、28]。 人間による地下水への窒素の投入とその沿岸生態系への悪影響は、ハワイで盛んに研究されている[29,30,31]が、火山性、深層、淡水帯水層とその地下微生物群集における過剰な窒素の影響についてはまだ研究されていない。特徴づけられる。

N に加えて、硫酸塩の存在は地下水系の群集構造を推進し、多くの場合、基質と電子供与体の利用可能性との間の関連性を示しています [5、32]。 硫酸塩 (SO42-)、硫化物 (S2-)、多硫化物 (SxO62-)、チオ硫酸塩 (S2O32-)、亜硫酸塩 (SO32-) などの S 種の存在は、地熱活動または地下水系の海水からのインプットを示しています。 33、34、35]。 地下水中の SO42- の存在は非生物反応の生成物に起因することが多いですが、嫌気性と好気性の両方の生物学的硫化物の酸化は、ほとんどの環境で熱力学的に有利です [36]。 さらに、還元された S、C、および Fe の相対的な利用可能性も、硝酸塩除去経路の重要な決定要因です [26]。 炭素が制限された系に S が存在する場合、脱窒は微生物を介した還元硫黄の硫酸塩への酸化によって促進され [23]、非生物的な硫酸塩の生成よりもはるかに速く起こります。

フアラライ流域 (ハワイ州コナ) には地表流出や排水がなく [37]、半乾燥気候であり、都市用水や農業用水の利用が地下水に完全に依存しているため、都市開発によるストレスに対して非常に脆弱である [38] ]。 さらに、ケアウホウ帯水層の開発を支援する経済的需要により、これらの帯水層の開発が求められ、地下水供給の質に過度の負担をかけています。 この流域には、塩水侵入、エアロゾル堆積、地熱活動による S 流入だけでなく、個人の OSDS による大量の N 流入の可能性があります。 さらに、変動する降雨パターンは全体的な乾燥傾向を明らかにしており、気温の上昇により涵養量と地下水貯留量が減少し、安全で安全な淡水供給の将来が脅かされると予測されている[39、40]。

この研究では、ハワイ島の深い火山性帯水層における窒素と硫黄の循環に関する、地下微生物群集の構造と機能を調査しました。 私たちは、1) フアラライ流域における地質と土地管理の実践が帯水層の地球化学にどのような影響を与えたか、2) 地溝帯沿いの地熱投入量 (S) やケアウホウ帯水層南部の OSDS (N) 投入量を含む微生物群集の変動を引き起こす要因、および3) N と S の循環に対する微生物の機能的能力と、それがこれらの帯水層の地球化学的空間パターンによってどのように変化するか。 ハワイの大規模で複雑な地下水火山帯水層は、さまざまな地質や土地管理慣行にわたる微生物群集の N 循環機能と S 循環機能を特徴付ける機会を提供します。 この研究は、この流域の公衆衛生と将来の開発に影響を与える飲料水資源の水質低下に対処しなければならない土地と水の管理者にとって、意味のあるものです。

ハワイ島は、ハワイ諸島で最大(10,464 km2)で最も若い島である [41]。 この島は、空間的および時間的溶岩流が重なり合う 5 つの楯状火山と、複雑な水理地質学的帯水層のつながりを形成した地熱的に活動的な地溝帯によって形成されました [42、43]。 フアラライは平均海抜 2500 m の最高標高を持ち、3 番目に活発な火山であり、キホロ帯水層系とケアウホウ帯水層系から構成されています [44、45]。 玄武岩流と噴石丘がフアラライを形成し、主に火山の頂上から北西、北東、南東に向かう 3 つの地熱活動が活発な地溝帯に沿って位置しています (図 1) [46]。 フアラライ流域はハワイ島の風下（乾燥）側に位置し、コナ海岸沿いの年間降水量は204～750mmの範囲ですが、コナ降水帯の上流では750～1350mmの年間降水量がより多くなります[47]。 。

サンプル サイトはグループ (N1、S、N2、N3) ごとに色分けされており、フアラライ リフト ゾーンは方向 (北、北西、南東) ごとに名前が付けられています。 農地は水色の網掛けで示され、OSDS サイトは黒丸で示されます。

地下水サンプルは、2017 年 8 月から 2019 年 3 月まで四半期ごとに、19 個の私有および公有の垂直または斜坑生産井から収集されました（図 1; 補足情報（SI））。 生の地下水サンプルは、15 ～ 20 分間の井戸パージの後 [48]、井戸ポンプステーションで 10 L のキュビテイナーを 3 回サンプル洗浄した後、塩素処理する前に収集され、フィールド実験室に到着するまで 4 °C で保管されました。 地下水を酸洗浄した 250 mL HDPE (Nalgene) ボトルにサブサンプリングし、地球化学分析まで 4 °C で保管しました (15 ～ 30 日間)。 3 つの 2 L サンプルを、最初に直径 47 mm 0.8 μm (GH Polypro、ミシガン州ポール ゲルマン社) で濾過し、次に孔径 0.2 μm の親水性ポリプロピレン膜 (ミシガン州ポール ゲルマン社) フィルターで濾過し、両方のフィルターを使用しました。 DNA 抽出前に -20 °C で凍結しました。

地下水を酸洗浄した 250 mL HDPE (Nalgene) ボトルに分離し、栄養素分析まで 4 °C で保管しました (15 ～ 30 日間)。 栄養素分析の標準方法は、4 チャネル自動分析装置 (Astoria-Pacific International、Astoria Pacific、Clackamas、OR) の製造プロトコルに従って行われました。 総 N および P は、アルカリ過硫酸塩消化後の PO43- および NOx- として分析されました [49]。 栄養素濃度は、NO3- + NO2- = NOx- として決定されました。 オルトリン酸塩、(PO43-); ケイ酸塩（Si）; アンモニウム (NH4+); 全窒素、(TN); および全リン (TP)。 YSI Pro Plus マルチパラメータ水質計を使用して、ポンプのフラッシング後および採取前に、地下水温度 (°C)、pH、溶存酸素 (DO、mgL−1)、および比伝導率 (SPC、μS cm−1) を測定しました。 DNA分析用の水（YSI, Inc.、オハイオ州イエロースプリングス）。 主要イオン (SO42-、マグネシウム、Mg2+、塩化物、Cl-) および選択された微量金属 (クロム、Cr、鉄、Fe、およびマンガン、Mn) のサンプルは、47 mm、孔径 0.2 μm の親水性ポリプロピレンでろ過されました。膜（Pall Gelman Inc.、ミシガン州アナーバー）を再利用可能なフィルターホルダーおよびレシーバー（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）にセットし、酸洗浄した 60 mL HDPE ボトルに分離しました。 地球化学分析に関する詳細情報は、補足情報に記載されています。

地理的空間土地利用データは、空間分析を実行するための R ソフトウェア用の sf パッケージ [50] を使用して分析されました。 サンプル サイトは、各サイトの周囲 1 km の円としてベクトル データに変換され、土地利用データがサイトごとに集計されて比較されました。 土地利用のタイプには、高温の可能性（推定されるカルデラ境界/地熱活動）、農業（農地と牧草地、果樹園、ブドウ園、観賞用園芸）、土地利用計画と配分（都市部の人口密度の高さ、農村部の人口密度、保護された土地）、ゴルフコースやリゾートとしてのエーカー、OSDS の量と 1 日あたり数百万ガロンの総排水流束 [51]。

DNeasy PowerWater Kit (QIAGEN、メリーランド州ジャーマンタウン) を使用して、PowerWater DNA Extraction プロトコールに従って、すべてのフィルターから DNA を抽出しました。 16S rRNA 遺伝子配列決定のためのライブラリーの調製は、補足情報 [52、53] に記載されているプロトコルに従って、MiSeq Illumina プラットフォーム用のデュアルインデックスプライマーを使用して、研究の長さと 2018 年から 2019 年の四半期ごとのサンプリングのため、4 つの別々のライブラリーで実行されました。 配列決定は、カリフォルニア大学アーバイン校の UCI Genomics High-Throughput Facility で Illumina MiSeq (300 サイクル、V3 化学キット) で実行されました。 16S rRNA、dsrA、および nirS 遺伝子の定量 PCR (qPCR) 分析の方法は、補足情報に記載されています。

配列データは MetaFlow|mics パイプライン [54、55] を通じて処理されました。 dada2 R パッケージ [56] は、生のリードをフィルタリング、ノイズ除去し、アンプリコン配列バリアント (ASV) にマージするために使用されました。 リードは位置 250F および 170R で切り詰められ、品質スコア <2 または >3 の塩基が 1 つ以上含まれている場合は破棄されました。 シーケンスエラーの確率は、dada2 の反復学習エラー関数でモデル化され、デフォルトのパラメーターを使用した反復分割アルゴリズムでノイズ除去されました。 リードはマージされ、20 塩基未満のオーバーラップを持つペア、または 2 つ以上の不一致を持つペアは破棄されました。 mothur v1.44.1 [57] と Silva データベース (バージョン 138) [58] の両方を、配列の位置合わせと注釈付けに使用しました。 (すべてのシーケンスにわたって) 5 ～ 95 パーセンタイルの範囲外にある開始位置または停止位置を持つシーケンスは破棄されました。 潜在的なキメラは、Mothur で実装されている VSEARCH [59] で削除され、RDP 分類器 [60] を使用して分類法が割り当てられました。 門レベルで分類学的情報がない、または一致するミトコンドリアまたは葉緑体を持たない ASV は廃棄されました。 配列は BioProject ID: PRJNA819449 で参照できます。 統計分析は、Phyloseq [61]、Vegan [62]、DESeq2 [63]、factoextra [64]、sf [50]、および R の基本統計パッケージ [65] を使用して実行されました。 栄養素および主要イオン濃度は、主成分分析 (PCA) の前に Z スコア変換されました (mg L-1)。 ASV はベータ多様性 (CCA、NMDS、PERMANOVA) 分析のために 2000 までサブサンプリングされ、99999 個の順列で PERMANOVA テストが実行されました。 最初のベータ多様性分析は、0.8 μm と 0.2 μm の 16S コミュニティを比較して実行されましたが、有意な差は観察されなかった (Permanova p > 0.5) ため、さらなる分析のためにサンプルを組み合わせました。

16S rRNA 遺伝子に基づく推定の機能アノテーションは、FAPROTAX (原核生物分類群の機能アノテーション; [66]) のバージョン 1.2.4 を利用して作成されました。Silva に反映されている微生物の特定のクレードの分類における最近の分類学的更新 [67] により、データベース (Silva138) には含まれていますが、FAPROTAX データベースには含まれていないため、ゲノム分類データベース (GTDB) を使用して、Silva138 と一致するように推定上の N および S サイクラーの FAPROTAX 分類群に手動で再アノテーションを付けました。これらの分類群の再分類の表と、それらに関連する代謝が提供されます。補足情報に記載されています。

差次的存在量解析 (DESeq2) は、RNA-seq データの遺伝子レベル発現解析用に設計されましたが、我々の分析で利用されているように、ハイスループット データにおける差次的存在量の種の検出に適応され、推奨されています [68]。 ASV 蔓延率が 3 を超える N および S サイクル機能を持​​つ属に対して、差次存在量検定を実行しました。正規化プロセスで幾何平均がゼロになるのを防ぐために、疑似カウント 1 を使用しました。 P 値は Wald 検定を使用して計算され、多重仮説検定は Benjamini-Hochberg 法で調整されました [69]。 すべてのペアごとのグループ比較から差次的に豊富な ASV が抽出され、調整された p 値が 0.1 未満で、log2 倍数変化が 1 を超える場合に、ヒート マップでの表示用に選択されました。表示された存在量の値は、各サイトで合計され、次に変換されました。相対的存在量。 ヒート マップの視覚化を改善するために、相対存在量の値が ASV ごとの Z スコアに変換されました。 DESeq2 分析から表示される ASV のリストは、SI に提供されます。

主成分分析 (PCA) に基づいて、サンプリング地点全体の地下水の地球化学は 2 つの異なるグループに分類されました (PCA、図 2A)。 サンプルは、フアラライ地溝帯沿いの 5 つの井戸からなる S グループ (図 1) と 11 の井戸からなる N グループに分類されました。 グループ間の差異の主な要因はマグネシウム (PC1 - 38.2%)、次にアンモニウム (NH4+; PC2 - 16.0%) であり、これらを合わせて地球化学で観察された変動の 54.2% を説明しました。 N グループは、周囲の土地利用分類に基づいてさらに区別されました。 土地利用に基づく PCA により、観察された変動の 81.2% を説明する 4 つの異なるグループが明らかになりました (図 2B)。 グループ S は地熱の影響の可能性が高い地域に基づいて独自のクラスターを形成しましたが、グループ N のサンプルはさらに N1 (農村の土地利用)、N2 (都市および OSDS)、および N3 グループ (農業、図 2B) にクラスター化されました。 。 PCA により、OSDS 量がサンプルの変動の主な要因 (PC1 - 48.8%) であり、次に保護された土地 (PC2 - 32.4%) であることが明らかになりました。

地下水と、A 地球化学変数、B 土地利用および地質との関連を示す主成分分析 (PCA)。 要約変数はサンプル グループ (N1 四角形、S 円形、N2 三角形、N3 菱形) ごとに色分けされており、大きな形状は主変数の平均を表し、黒いベクトルはベクトルの長さから推測される関連の強さを表します。 地球化学には pH が含まれます。 Cr クロム、DO 溶存酸素、NOx 硝酸塩 + 亜硝酸塩、TN 全窒素、NH4 アンモニウム、Mn マンガン、Fe 鉄、温度、Cl 塩素、SPC 比コンダクタンス、PO4 オルトリン酸、TP 総オルトリン酸、SO4 硫酸、Mg マグネシウム。 土地利用には、保全土地 (LU_Consv)、農業 (Ag_Acres)、高度歯科都市 (LU_HDUrban)、農村 (LU_Rural)、ゴルフ コース (Glf_Acres)、リゾート (LUResorts)、OSDS 数量 (OSDS_Qty)、および OSDS N フラックス (OSDS_NFlux) が含まれます。 、地熱活動の確率は 35% (Prob_HT35)。

S グループの地球化学は、DO、NOx-、SO4-2、PO4-3、Si、SPC、塩分、および pH に関して N2 および N3 とは大きく異なりました (Tukey、p < 0.001) (図 3)。 グループ S は、平均値が著しく高く、硫酸塩濃度が変動することを特徴としていました (179.02 mg L-1; 図 3)。 グループ S の 1 つのウェルからのいくつかのサンプルは、味を考慮した EPA の二次最大汚染物質レベル閾値 (250 mg L-1) よりも高い SO42- 濃度を持っていました [70]。 S グループは、DO (5.03 mg L-1)、NOx- (0.88 mg L-1)、pH (6.93) の平均濃度が低く、平均 SPC (1.57 mS cm-1) が高かった。 さらに、PO43- (0.29 mg L-1) と Si (33.91 mg L-1) の平均値は S グループで有意に高かった。それに比べて、NOx- は N2 と N3 で有意に高かった (Tukey、p < 0.001) N3 からのサンプルは、NOx- の平均濃度が最も高かった (1.21 mg L-1) が、N2 (1.06 mg L-1) とは大きく異なりませんでした。 NOx- の 2 つの外れ値サンプルは、N2 (5.73 mg L-1) と N3 (8.28 mg L-1) から発生しましたが、地下水中の硝酸塩の EPA 最大汚染レベル (mcl) (10 mg L-1) を依然として下回っていました。 21]。 N のグループは、SPC が著しく低く (Tukey、p < 0.001)、pH が高くなります (Tukey、p < 0.001; 図 3)。 地球化学における有意な差は、サンプル時間（月/年、補足図1）では観察されませんでした。 水質パラメータは公開されており、Hydroshare データベースで入手できます [71]。

各変数の平均値 (水平線) と個々のサンプル値 (黒丸) がグループごとに示されています。 DO、NH4、NOx、SO4−2、PO43−、Si の縦軸は mg L−1、SPC (μS cm−1)、および温度 (℃) で測定されます。 事後分析 (Tukey-post hoc) は、グループ間の有意差を決定するために実行され、有意差を示す文字でラベル付けされています。

マントルテストにより、地球化学と農業、都市密度、ゴルフコース、およびリゾートの土地利用タイプとの間の重要な空間的関係が明らかになりました（表1）。 DO (R2 = 0.66、p = 0.001)、pH (R2 = 0.41、p < 0.05)、SPC (R2 = 0.31、p = 0.01)、および SO4−2 (R2 = 0.90、p = 0.001) を含む地球化学変数は、これらはすべて、ゴルフコースやリゾートの土地利用と強く相関しています。 S グループは、ゴルフ場およびリゾート地として最大の平均土地利用（1,679 km2）と地熱確率の高い地域を持っています（図 1）。 対照的に、NOx 濃度は農地 (R2 = 0.45、p < 0.01) および都市密度 (R2 = 0.32、p < 0.01; 表 1) と強い相関がありました。 都市として分類される最大の平均面積 (5,160 km2) はグループ N3 で発生しましたが、農地利用 (牧草地、保護地) はグループ S と N1 で最大で、平均は 1.1 × 106 km2 でした。 OSDS の平均量は、N3 の 4009 個と比較して、N2 で 1 区画あたり 5146 単位で最も多く、S で発生した最小量は 1 区画あたり 143.7 単位でした。 農村部の土地利用は、平均面積 1597 km2 のすべての N グループと比較して、グループ S の 7080 km2 で断然最大でした。

qPCR 16S rRNA 遺伝子コピー mL-1 から推定した微生物密度は低く、地球化学グループ間で有意に異なりました (ANOVA、p < 0.001)。 最大の平均密度は N3 (9.7 × 104 コピー mL-1、図 4) で測定され、最小存在量は S (2.5 × 103 コピー mL-1) で測定されました。 グループ N3 は S (Tukey、p < 0.01) および N2 (Tukey、p < 0.001) よりも有意に高い密度を持っていましたが、N1 と違いはありませんでした。

事後分析 (Tukey-post hoc) はグループ間で実行され、有意差を示すために文字でラベルが付けられています。

2017年5月から2019年3月までに収集された220サンプルから、合計12,973個のASVが特定されました。平均サンプルサイズはサンプルあたり12,966リードで、範囲は2079～42,804でした。 すべてのサンプルはプロテオバクテリアによって支配されており（補足図2）、平均相対存在量はガンマプロテオバクテリア（Ɣ）で43.6％、アルファプロテオバクテリア（α）で12.9％でした。 最も豊富な上位 10 位（補足図 2）は、地下水サンプル全体の相対存在量の >50% を占めました。 微生物群集のベータ多様性は、PCA（S、N1、N2、N3）グループ間で有意に異なりました（PERMANOVA、p < 0.01;補足図3）。 ただし、アルファ多様性（ピルー指数とシャノン指数）は、PCA グループ間で有意な差はありませんでした（補足図 4）。

正準対応分析（CCA）により、地下水微生物群集の構造、地球化学、および土地利用の間に有意な関連性があることが特定されました（CCAモデルのANOVA、p < 0.001;図5）。 農地利用 (CCA1)、pH、OSDS 量、および NOx- は、N1 および S グループのリゾート地利用と SO4-2 濃度 (CCA2) の関連と比較して、N2 および N3 グループの微生物群集と有意に関連していました。テスト（表 1）では、微生物群集が OSDS 密度（R2 = 0.43、p < 0.05）および農村部の密度（R2 = 0.32、p < 0.05）と相関していることが明らかになりました。 マンテルテストでは、コミュニティ構造と農業、都市密度、地溝帯、ゴルフコースまたはリゾート地、保護地、または地球化学変数との間に有意な相関関係は検出されませんでした（表1）。

円はグループごとに色付けされた各井戸のサンプルを表し、黒いベクトルはコミュニティ、地球化学、土地利用の間の関連を表します。

グループ全体で合計 865 個の ASV (総相対存在量の 6.7%) が、原核生物分類群の機能的注釈 (FAPROTAX) [66] に基づいて、属と目レベルの間で推定上の N および/または S サイクラーとして分類されました。 グループ間の 16S rRNA 遺伝子存在量の違いを考慮して、PCA グループごとに相対的な配列存在量を計算しました。

推定上の S サイクラー (353 個の ASV) の相対存在量は、グループ間で有意に異なりました (p < 0.001; 図 6A)。 グループ S は、推定上の S 周期生物の平均相対存在量が最も高く (26.5%)、N1 (11.8%; Tukey、p < 0.01) とは大きく異なりました。 グループ N2 (25.2%) は、N3 (18.8%; Tukey、p < 0.05) および N1 (Tukey、p = 0.0012) よりも S サイクラーの平均相対存在量が有意に高かった。 推定上の S 酸化剤 (159 の ASV) はアシネトバクター属が大半を占め、平均相対存在量はグループ S (20.5%) で最も高く、N2 (18.7%)、N3 (15.5%) と比較して最も低く、N1 (7.9%;図６Ｄ）。 硫黄還元剤は、Desulfobulbales 目に分類される未培養の属によって支配され、グループ全体で平均相対存在量が低く (1.0%)、グループ S で相対存在量が最大でした (1.5%、図 6E)。 硫酸塩還元遺伝子 (dsrA) の存在量も非常に低かったが、すべての PCA グループ間で有意に異なりました (ANOVA、p < 0.001、図 5)。 グループ N1 は、N2 よりも有意に高い dsrA の平均存在量 (2.2 × 103 コピー mL-1) を持っていました (p < 0.01)。 グループ S (1.89 × 102 コピー mL-1) も、N1 (2.15 × 103 コピー mL-1) と大きく異なりました (p < 0.01)。 ゲノムあたり dsrA 遺伝子コピーが平均 1 つであると仮定すると [72、73]、グループ S の微生物群集の 7.7% が S を減少させる可能性があるのに対し、N1 では 5.3%、N2 では 1.1%、N2 では 0.94% です。 N3.

ASV の相対存在量 (%) は、AN および S 代謝を含む機能的な PCA グループによって表示されます。B 脱窒には硝酸塩、亜硝酸塩、亜酸化窒素脱窒が含まれます。CN 還元には N または S 還元、硝酸塩還元が含まれます。DS 酸化には光独立栄養性 S 酸化が含まれます。そしてES削減。

推定上の N 循環微生物 (512 個の ASV) も、グループ間で相対存在量が大きく異なりました (ANOVA、p < 0.001、図 6A)。 グループ S は N サイクラーの平均相対存在量が最も高く (28.9%)、N3 (20.91%; Tukey、p < 0.05) および N1 (15.27%; Tukey p < 0.01) とは大きく異なりました。 グループ S と N1 では、グループ N2 と N3 の硝化生物の存在量が低いのと比較して、硝化生物の相対存在量が同様でした。 ほとんどの硝化微生物は、S グループの Candidatus Nitrotoga 属 (細菌) と比較して、N グループの Candidatus Nitrosotenuis 属 (古細菌) に属していました。異化的 N 還元が可能な微生物 (還元カスケードの任意の部分を介した; 396 ASV) は、高い平均相対存在量を示しました。すべてのグループにわたって（18.5％）、アシネトバクター属のƔ-プロテオバクテリアの5つのASVが大半を占め、相対的に最も多く存在したのはグループS（11.1％、図6C）でした。 次に豊富な N 還元剤は、N3 グループで相対存在量が最も高く、Aquabacterium 属に分類されました (1.1%、図 6C)。

脱窒 (硝酸塩、亜硝酸塩、または亜酸化窒素を N2 に還元できる) 微生物 (212 ASV) の平均存在量は低く (3.14%)、グループによって有意な差はありませんでした。 脱窒分類群の最大の寄与は、グループ N2 (0.45%) および S (0.42%) で相対存在量が最も大きいデニトラタソーマ属、およびグループ S のフラボバクテリウム属 (0.38%; 図 6B) によるものでした。 脱窒遺伝子 (nirS) の qPCR によって測定された脱窒電位のより正確な測定により、すべてのグループ間で大きく有意な差が示されました (ANOVA、p < 0.001、図 5)。 N3 グループの平均 nirS 存在量（4.5 × 104 コピー mL-1）が最も高く、続いて S（3.88 × 103 コピー mL-1）、N1（3.76 × 103 コピー mL-1）、N2（1.0 × 103 コピー mL-1）でした。 −1)。 N3 グループのサンプルは、nirS 遺伝子の存在量に関して N2 (p < 0.001) および S (p < 0.01) とは大きく異なりました。 ゲノムあたり平均 1 つの nirS 遺伝子コピーを推定すると [74, 75]、N1 では 9.3%、N2 では 30.1%、N3 では 46.3% と比較して、グループ S 微生物群集の大部分 (>100%) は脱窒の可能性を持っています。

差次存在量分析（DESeq2）により、NおよびS代謝について同様の機能的潜在力を持つグループ全体で、有意に分化したASVの独自のクラスター化（調整p値<0.1）が明らかになりました（図7）。 グループ N1 と S は、差次的に濃縮された ASV の数が最も多く (それぞれ 68 と 64)、グループ N2 と N3 では少なかった (それぞれ 35 と 38)。 推定上の N 機能代謝 (例、好気性硝化、脱窒、および異化的 N 還元) はすべてのグループに存在しますが、分類群によって異なります。 推定上の S 機能代謝（例、S 酸化および S 還元）は S 群と N1 群で非常に豊富であり、S 群では推定上の S 酸化 N 還元物質（Acinetobacter）が大半を占めています。 大きく異なる ASV の概要N および S 代謝によって組織化された最高の濃縮（平均倍率変化）については、補足情報および補足表 1 で説明します。ここで示した結果は、PCA グループ間で区別される主要な推定上の S 酸化、N 還元分類群に焦点を当てています。

選択した各 ASV の存在量値を部位ごとに合計し、相対存在量に変換し、各 ASV の Z スコアに変換しました。 アシネトバクターとして識別された ASV 番号が強調表示されます。

推定上の S 酸化はグループ S (27 ASV) と N1 (20 ASV) で高度に濃縮され、S 酸化と N 還元の両方が可能な分類群が大半を占めました (図 7; 補足表 1)。 グループ S で最も濃縮された ASV は、推定上の S 酸化および N 還元因子であるアシネトバクター属に属していました (12 個の ASV)。 しかし、別の推定上の S 酸化、N 還元物質である Thiobacillus (3 つの ASV) は、グループ N1 のすべての分類群にわたって最も高い濃縮度を示しました。 グループ N2 分類群にはアシネトバクターだけでなくシュードモナスも多く含まれていましたが、グループ N3 にはロドバクターとデクロロモナスからの独自の寄与がありました。 さらに、N 還元を伴わない推定上の S 酸化が可能な分類群はグループ間で多様であり、グループ N1、S、および N2 に独自の寄与が見られました。 グループ S には、スルフリクルバム (2 つの ASV) およびメチロバクテリウム メチロルブルム (3 つの ASV) からの寄与があったのに対し、グループ N1 には、スルフリフスティス (2 つの ASV)、マグネトビブリオ (1 つの ASV)、マイオテルムス (1 つの ASV) およびからの寄与を含む推定 S 酸化剤が含まれていました。グループ N2 の Chromatiaceae (1 ASV) および Chlorobium (1 ASV)。

北西地溝帯付近に位置するグループ S の地下水サンプル (図 1) は生物地球化学的に独特で、高い SO42- を特徴としていました。 グループ S のサンプルには、地熱ガス放出 [18] を示唆する明確な火山性 CO2 シグナルがあり、これには硫黄ガス (例: H2S、SO22-) [76] が含まれる可能性があり、また、我々のサンプルと同様に PO43- および Si の濃度が上昇していることが示されています。岩石鉱物の風化の進行。 地溝帯 (C14) から遡る地下水の年代は、過剰な地熱由来の無機 C 、または帯水層の残りの部分との接続性の低下をもたらす孤立した流路のいずれかにより、はるかに古い水 (>5000 年) を示しています [77, 78]。 再充電量の減少と年齢の上昇は、火山のガス放出による SO42- や S2O32- などの酸化 S 種の非生物的生成の可能性が減少していることを示しています。 しかし、生物的 H2S 酸化速度は、好気条件と嫌気条件の両方で非生物酸化をはるかに上回ることが示されており [36]、これらのサンプルにおける SO42- 生成が微生物の活動によって生成される可能性があることをさらに示唆しています。

多変量解析により、他の地下水マイクロバイオーム研究と一致して、SO42- 濃度が S 群と N1 群の両方で微生物群集構造の重要な要因であることが実証されました (図 4 CCA)。 S グループは、アシネトバクター属に属する推定上の S 酸化剤の高い​​多様性 (159 個の ASV のうち 45 個) によって支配されていました。 この属は、汎用性の高いゲノムと水処理の大きな可能性を備えた貧栄養地下水で特徴付けられています [79、80]。 FAPROTAX はアシネトバクターを N 還元物質として分類しました [66]。しかし、より最近の研究では、メンバーが有機基質 (従属栄養性) と好気的脱窒を使用した硝化 (アンモニアの硝酸塩への酸化) 能力を持っていることが示されました [80]。 いくつかの種のアシネトバクターが、硫黄、マンガン [81]、および H2 [79] の廃水処理を含むいくつかの産業システムで報告されています。 アシネトバクター株は、NO32-をN2に還元する完全な遺伝子セットを備えた従属栄養性と独立栄養性の両方が可能な微生物群集を使用してS酸化からエネルギーを獲得し、脱窒硫化物除去のプロセスで最初に同定された[81]。

アシネトバクターに分類される分類群は、他の N グループよりも S グループに 4 倍多く含まれていました。 私たちのサンプル中にアシネトバクターが存在することは、S と N の機能代謝の直接的な関連を示している可能性があります [82, 83]。これはサンプル全体にわたる高い nirS 遺伝子存在量によっても裏付けられています。 アシネトバクターには nirS 遺伝子のコピーが 1 つ含まれており [80]、nirS の相対存在量が高いことは、S グループにおける微生物による S 酸化と N 除去の大きな可能性があることを示唆しています。 この研究は、ハワイの火山帯水層におけるアシネトバクターの機能的能力を特定します。タイプの地下水微生物群集であり、硫黄からのエネルギーを利用して窒素を完全に除去する可能性があります。 アシネトバクターは、低炭素低温システムの好気条件下（>2 mg L-1 DO）で高い窒素除去効率を実証しており、0.203 mg L-1 h-1 の速度で最大 40.2% の窒素をガスとして除去できます。 [84]。 N2 および N3 グループと比較して S グループの高い硫酸塩濃度と著しく低い NOx- は、N 還元に必要な電子がアシネトバクター (S グループ) およびおそらくチオバチルス属による硫黄生成 SO42- の微生物酸化に由来するという我々の仮説をさらに裏付けています。 (N1グループ)。

土地管理は、主にグループ N2 および N3 (ケアウホウ) における都市化の影響 (OSDS 量) から、フアラライ流域の北地球化学に影響を与えます。 窒素の投入量は、地下水中の微生物群集の構造に大きな影響を及ぼし、人為的な窒素源によって異なる可能性があります [6、23、85]。 この研究では、OSDS の量が差異の主な要因 (48%、図 2B) であり、微生物群集の構造と有意に関連していました (図 4)。 OSDS が地下水の地球化学の推進要因であることを示す結果は、ケアウホウ帯水層 (N3) の沿岸地域に対して開発された地下水の流れと栄養塩輸送モデルと一致しています [35]。 このモデルは、OSDS が帯水層に最も大きな割合の栄養塩 (総窒素の 54%) をもたらし、他の非点源汚染物質と比較して水質に最も大きな影響を与えたことを示しています [86]。 この研究では、OSDS 量が多い都市密度の高い地域 (N2、N3) は、受動的な農地利用が優勢な同等の地域 (N1) よりも NOx 濃度が著しく高かった。

農業および廃水からの人為的影響は、地下水生態系における地球化学、水質、および微生物群集構造（特に窒素循環官能基）の重要な決定要因である[12、21]。 この研究では、高度に濃縮された推定微生物の窒素除去機能は、アシネトバクターによる硫黄酸化による完全な脱窒（好気的脱窒と結合した従属栄養性硝化）である。 我々は、S 化合物の存在、硫酸塩濃度の上昇、アシネトバクター集団の高度な濃縮により、N グループと比較して S グループでは微生物媒介 N 除去の可能性がより高いと仮説を立てています。

不安定な有機炭素の利用可能性は、地下水における従属栄養的窒素除去の実行可能性を制限すると考えられている[24、87]。 十分に酸化された下水排水には、環境によっては微生物による窒素還元プロセスを制限する不安定な炭素が少量含まれる傾向があります [23]。 分類群の比較と存在量（nirS）に基づいて、微生物媒介N還元の可能性はグループSと比較してグループN3で最大ですが、グループN3は電子供与体の利用可能性によって制限される可能性がありますが、グループSではSの存在により電子供与体の利用可能性が高くなります。化合物。 これらの地下水帯水層における微生物の窒素還元能力と、特にグループ N2 および N3 で観察された OSDS の影響を強く受けている地域で、グループ全体に現れる差異を明らかにするには、さらなる研究が必要です。

フアラライ流域における化学合成富栄養性硫黄酸化と脱窒の潜在的可能性が関連しているという発見は、水管理者にとって重要な意味を持つ。 硫化物の酸化による脱窒は窒素負荷の減少につながりますが、代謝は坑井やポンプの運転に潜在的に有害です。 硫酸塩濃度、水の硬度、腐食が増加する可能性があり、地下水が地表に汲み上げられる際に酸素に遭遇すると、溶液からイオンが析出することがあります[6、23]。 地溝帯沿いの私有井戸の所有者との個人的なコミュニケーションにより、一部の井戸では悪臭を放つ悪臭のある水と降水が発生していることが確認されました。 しかし、アシネトバクターの顕著な存在は、資源が制約された地下水帯水層に生態系サービスを提供する窒素と硫化物を同時に除去する火山性地下水微生物群集の生物修復の可能性を推測します。

現在の研究中に生成および分析されたデータセットは、Hydroshare リポジトリ https://www.hydroshare.org/resource/d812bbb7c93348999371c9f1f517297f/ および国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) リポジトリ ID PRJNA819449 で入手できます。 この研究で議論されたすべてのさらなるデータと分析は、原稿の補足情報で提供されます。

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この作業を進めるために時間、サイトへのアクセス、知識を惜しみなく提供してくださったハワイ州コナの数多くのコミュニティ グループに感謝いたします。 協力してくれたハワイ郡水道局、ハワイ水道サービス、パム・マッデンを含むハワイ政府自然エネルギー研究所、キース・オルソン、水資源管理委員会、コハナイキ・クラブ、そしてグレッグ・チュンに感謝します。私たちが井戸にアクセスし、地下水サンプルの収集を手伝ってくれました。 マハロ・ヌイからショーン・クリーブランド、ITS、およびハワイ・データ・サイエンス・インスティテュートに技術支援とサイバーインフラストラクチャのサポートを提供しました。 この論文は、ハワイ大学マノア校の SOEST Contribution No. (出版後未定) です。

この研究は、国立科学財団研究インフラ改善賞 (RII) トラック 1 の資金提供によるハワイ EPSCoR プログラムによって支援されました。「アイク ワイ: ハワイの水の未来の確保賞 #OIA-1557349 および高度なサイバーインフラストラクチャ - タピス フレームワーク #1931439」 #1931575。 この研究は、部分的には、カリフォルニア大学アーバイン校のがんセンター支援助成金 (P30CA-062203) および NIH の共有機器助成金 1S10RR025496-01、1S10OD010794-01 のゲノミクス ハイ スループット施設共有リソースへのアクセスを通じて可能になりました。および1S10OD021718-01。

ハワイ大学マノア校、パシフィックバイオサイエンス研究センター、ホノルル、ハワイ州、米国

シェリー・J・ワトソン、セドリック・アリスダケシアン、マリア・ペテロ、ケクイアポイウラ・ケリプレオレ、キアナ・L・フランク

ハワイ大学マノア校、情報コンピュータ科学部、ホノルル、ハワイ州、米国

セドリック・アリスダケシアン

ハワイ大学マノア校、海洋生物学大学院プログラム、ホノルル、ハワイ州、米国

ケクイアポイウラ ケリプレオレ

ハワイ大学マノア校地球科学部、ホノルル、ハワイ州、米国

ダイアモンド K. タチェラ、ブリトン K. 奥畑、ヘンリエッタ デュライ

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SW と KF は、サンプルの取得、データ分析、結果の解釈など、原稿の提出につながる作業を考案および設計しました。 CA はデータ分析と結果の解釈に貢献しました。 KF、KK、BO、DT、SW はデータ収集において重要な役割を果たし、MP、SW、KK は研究室でのサンプルの準備に貢献しました。 原稿は SW、KF、CA によって起草されました。 共著者の BO と HD は、原稿の改訂と最終版の承認に協力しました。 すべての共著者は、作品のあらゆる部分の正確性または完全性に関する疑問が適切に調査され、解決されることを保証するために、作品のあらゆる側面に対して責任を負うことに同意します。

キアナ・L・フランクへの手紙。

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転載と許可

ワトソン、SJ、アリスダケシアン、C.、ペテロ、M. 他地質と土地利用は、太平洋島帯水層の窒素と硫黄を循環する地下水微生物群集を形成します。 イズムコミュ。 3、58（2023）。 https://doi.org/10.1038/s43705-023-00261-5

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受信日: 2022 年 9 月 9 日

改訂日: 2023 年 4 月 18 日

受理日: 2023 年 5 月 24 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00261-5

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